Environmental DNA · 环境DNA

不见其形,
亦知其在。

鱼游过、兽饮水、鸟掠影 —— 生物无时无刻不在向环境中脱落细胞、黏液、粪便与配子。 这些残留的遗传物质被称为 环境DNA(eDNA)。 不必捕捞、不必惊扰,只需一瓶水、一抔土,就能读出一片生境的物种名录。

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1 L
典型水样体积
即可检出低丰度物种
数小时–数十天
水体 eDNA 半衰期
随温度、UV、微生物活性变化
10⁻¹–10⁻³
copies/µL
qPCR 典型检出限量级
取决于标记与体系
1 次测序
可同时鉴定
数十至数百个分类单元

01 / 定义

什么是环境DNA

环境DNA 指不经由捕获目标生物本体,而直接从环境介质中获取的、来源于生物体的 DNA 混合物。 它既包括完整细胞和细胞器内的 DNA,也包括游离态的、吸附在颗粒物或有机质上的胞外 DNA。

来源

体表黏液与皮肤细胞、鳞片、毛发与羽毛、粪便与尿液、精子与卵、创口与死亡后的组织碎屑、根系分泌物、花粉与孢子。

介质

淡水与海水最常用;此外还有土壤、湖泊/海洋沉积物、空气、雪与冰芯、洞穴滴水,乃至蜂蜜、树洞积水、动物饮水点等"天然采样器"。

存在形式

① 完整细胞内 DNA;② 与蛋白/膜结合的亚细胞颗粒;③ 游离胞外 DNA。三者粒径与降解速率不同,直接影响过滤孔径与保存策略的选择。

术语辨析: eDNA 泛指环境介质中的 DNA;eRNA 降解更快,可指示"活体/近期活动"; sedaDNA 特指沉积物中的古环境DNA,可回溯千年至数十万年尺度; bulk sample DNA(如整桶昆虫混合样)严格说属于"群落DNA",与 eDNA 常被并称但来源不同。

02 / 原理

eDNA 的"生命周期"

一段 eDNA 从离开生物体到被你的滤膜捕获,中间经历了五个相互竞争的过程。 理解它们,才能正确解释"检出"与"未检出"的含义 —— eDNA 信号是时间与空间上被抹匀过的生物量代理指标。

沉积物 / 底泥 ① 释放 Shedding ② 输运 Transport ③ 沉降 ④ 再悬浮 ⑤ 降解 Degradation
① 释放速率随生物量、体型、代谢强度、繁殖期与应激状态变化,种间可差几个数量级。
② 输运河流中可迁移数百米至数十公里;湖泊与海洋则受分层、环流影响,存在明显空间异质性。
③ 沉降 / ④ 再悬浮eDNA 吸附于颗粒物沉入底泥,浓度可比水体高 2–4 个数量级;扰动会将"历史信号"重新释放。
⑤ 降解微生物核酸酶为主导,叠加紫外、高温、极端 pH。多数水体半衰期在数小时到数天,冷暗低生产力水体可达数周。

由此推出的三条实操准则

  1. "检出"≠"此时此地存在"。需结合水文距离与降解速率,给出信号的时空置信范围。
  2. "未检出"≠"不存在"。必须报告检出限(LOD)与占据模型下的检出概率,而非简单的阴性结论。
  3. 样品要立刻"冻结时间"。现场过滤 + 即时低温/缓冲液保存,是决定成败的最大单一因素。

03 / 技术路线

从一瓶水到一张物种名录

  1. 1

    采样

    水样 0.5–5 L(视浊度);沉积物取表层 0–2 cm。每站点设置现场空白,采样器与容器一次性或漂白灭活。

    关键:上游→下游顺序作业,防交叉污染

  2. 2

    富集

    常用滤膜过滤(玻璃纤维 GF/F、混合纤维素 MCE、聚醚砜 PES,孔径 0.22–1.2 µm);低体积样可用乙醇/醋酸钠沉淀。

    关键:孔径与堵膜之间的权衡

  3. 3

    提取

    硅胶柱法(DNeasy 类)、CTAB/酚氯仿、磁珠法。沉积物与高腐殖质样品需加强抑制物去除(PVP、OneStep 等)。

    关键:抑制物 = 假阴性头号元凶

  4. 4

    检测

    按目标是"一个物种"还是"整个群落",分为靶向检测与宏条形码两条路。见下方对比。

    关键:先定问题,再选方法

靶向检测

qPCR / ddPCR

为单一目标物种设计特异性引物与探针,直接定量拷贝数。

  • 灵敏度最高,可检出个位数拷贝
  • ddPCR 绝对定量,对抑制物更耐受
  • 成本低、周期短,适合大规模例行监测
  • 一次只看一个(或少数几个)物种
  • 引物需做严格的体外/体内特异性验证,尤其是近缘种

典型用途:入侵物种预警、濒危种确认、检疫。

宏条形码

eDNA Metabarcoding

用通用引物扩增一段分类信息丰富的标记基因,高通量测序后比对参考库。

  • 一次获得全群落名录
  • 可做多样性、群落结构与时空比较
  • 数据可回溯复用,参考库更新后可重新注释
  • 受引物偏好性影响,半定量而非绝对定量
  • 分辨率受限于参考库完整度与标记长度

典型用途:生物多样性普查、生态健康评价、食性分析。

常用分子标记

标记目标类群常用引物 / 片段特点
12S rRNA鱼类、脊椎动物MiFish-U/E、Tele02、12S-V5片段短(~170 bp),抗降解,鱼类参考库较完善
COI后生动物(广谱)Leray fwhF2/mlCOIintR(313 bp)BOLD 库最大,但保守区少、通用性差、易扩增非目标
16S rRNA原核生物 / 两栖爬行515F–806R(V4);Batra/Vert-16S微生物群落金标准;脊椎动物版本用于两栖类
18S rRNA真核生物(广谱)V4 / V9 区覆盖极广,但物种级分辨率通常不足
ITS2 / rbcL / matK植物、真菌ITS2、rbcL 短片段植物条形码主力;ITS 长度变异大需注意
trnL (P6 loop)植物(降解样)g/h 引物,10–140 bp极短,适合粪便与古沉积物

提示:多标记(multi-marker)并行是当前主流 —— 单一引物永远看不全一个生态系统。

04 / 生物信息

下机数据怎么变成物种名录

01

质控

FastQC / MultiQC 查看质量分布、接头残留与重复度。

02

去引物 & 修剪

cutadapt 按锚定序列切除引物区,保留固定长度窗口。

03

降噪 / 聚类

DADA2 或 UNOISE3 生成 ASV;或 VSEARCH 97% 聚类为 OTU。ASV 已成主流。

04

嵌合体去除

去除 PCR 嵌合与低频伪序列,并做跨样本 index-hopping 校正。

05

物种注释

比对 NCBI nt / BOLD / MIDORI / SILVA / PR²;或用 SINTAX、IDTAXA、naive Bayes 分类器给出置信度。

06

过滤与校正

依据空白样扣除污染(如 decontam),设置最小 reads 阈值,合并技术重复。

07

生态统计

α/β 多样性、稀疏化或 CLR 变换、NMDS/PERMANOVA、占据-检出(occupancy)模型。

minimal_pipeline.sh
# 1) 去引物(以 MiFish-U 为例)
cutadapt -g GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC -G CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG \
         --discard-untrimmed -o R1.trim.fq.gz -p R2.trim.fq.gz R1.fq.gz R2.fq.gz

# 2) DADA2 降噪 → ASV 表(R)
Rscript -e 'library(dada2);
  ft <- filterAndTrim("R1.trim.fq.gz","R1.f.fq.gz","R2.trim.fq.gz","R2.f.fq.gz",
                      maxEE=c(2,2), truncQ=2, rm.phix=TRUE)
  dd <- dada(derepFastq("R1.f.fq.gz"), err=learnErrors("R1.f.fq.gz"))
  st <- makeSequenceTable(dd)
  st <- removeBimeraDenovo(st, method="consensus")
  saveRDS(st, "asv_table.rds")'

# 3) 物种注释
blastn -query asv.fasta -db nt -perc_identity 97 -qcov_hsp_perc 90 \
       -outfmt "6 qseqid sseqid pident length evalue staxids sscinames" > hits.tsv

上面是最小可用骨架;生产环境建议用 QIIME 2、OBITools3、Anacapa 或 nf-core/ampliseq 等成套流程,便于复现与版本追踪。

05 / 应用

eDNA 正在被用来做什么

🐟

渔业与水生生物资源

估算鱼类组成与相对丰度,补充或替代电捕、拖网等破坏性调查,尤其适用于深水与禁渔区。

🚨

入侵物种早期预警

在种群密度极低、传统方法尚无法发现时即给出警报,为清除争取窗口期。经典案例:北美亚洲鲤、欧洲美国牛蛙。

🦎

珍稀濒危物种监测

对大鲵、江豚、鳗鲡、蝾螈类等难以目视或不宜捕捉的物种做无损确认与分布制图。

🌊

水质与生态健康评价

以硅藻、底栖无脊椎动物、原生生物群落构建分子指数,替代耗时的形态学鉴定。

⛏️

古环境重建(sedaDNA)

从湖芯、冻土、洞穴沉积中恢复历史植被与动物群,重建千年尺度的气候-生态响应。

🌬️

空气 eDNA

用空气采样器捕获花粉、真菌孢子与陆生脊椎动物 DNA,已在动物园等场景验证可行性。

🧪

病原与检疫

监测水体中病原体(如壶菌 Bd/Bsal、鱼类病毒)、口岸压舱水与养殖水体的生物安全筛查。

🍽️

食性与营养关系

从粪便、胃含物中提取 DNA 解析食谱,重建食物网,无需解剖或形态学残渣鉴定。

🗺️

大尺度监测网络

标准化协议 + 自动采样装置,使跨流域、跨国家的长期生物多样性观测网成为可能。

06 / 权衡

优势与局限,同样重要

优势

  • 无损、非侵入 —— 不捕捞、不伤害、不惊扰,适用于保护地与濒危物种。
  • 灵敏度高 —— 低密度种群往往先被 eDNA 发现。
  • 成本效率 —— 单位人力覆盖的站点数远高于传统调查。
  • 标准化程度可控 —— 减少对分类学专家可得性的依赖。
  • 数据可复用 —— 序列永久保存,参考库更新后可重新分析。
  • 覆盖隐蔽生活史 —— 卵、幼体、夜行与穴居种同样留下信号。

局限

  • 不给个体信息 —— 无法直接得到体长、年龄、性别、健康状况。
  • 定量关系不稳健 —— 拷贝数与生物量之间受释放率与降解率强烈调制。
  • 污染风险贯穿全流程 —— 从采样瓶到实验室气溶胶都可能引入假阳性。
  • 参考库空缺 —— 许多类群、许多区域的物种尚无可比对序列。
  • 信号来源模糊 —— 可能来自上游、来自捕食者粪便、来自渔获物或污水排放。
  • 抑制物与低效提取 —— 高浊度、高腐殖质样品假阴性率上升。
结论:eDNA 是传统生态调查的强力补充,而非全面替代。最佳实践是"eDNA 做面上的筛查与预警,传统方法做点上的验证与个体级测量"。

07 / 质控

让结果站得住脚

eDNA 的可信度几乎完全建立在污染控制与对照设计上。下面是一份可直接拿去核对的清单。

必备对照

  • 现场空白(field blank):带纯水到现场,走完全部采样与过滤动作
  • 设备空白(equipment blank):重复使用的采样器每次清洗后取样
  • 提取空白(extraction blank):每批提取至少 1 个
  • PCR 阴性对照(NTC):每块板至少 1–2 个
  • 阳性对照 / 内标:验证扩增体系,评估抑制程度
  • 技术与生物学重复:qPCR ≥3 技术重复;每站点 ≥3 生物学重复

防污染操作

  • 物理分区:采样 → 提取 → 前 PCR → 后 PCR 单向流动,不得回流
  • 前 PCR 区使用正压洁净台、专用移液器与滤芯吸头
  • 10% 漂白液(≥10 min)灭活器材,再用纯水冲洗
  • 采样按低污染风险 → 高风险、下游 → 上游 的顺序
  • 切勿在同一空间处理组织样(高浓度 DNA)与 eDNA 样

报告应包含

  • LOD / LOQ 及其确定方法
  • 标准曲线效率、R²、Cq 阈值判定规则
  • 阳性判定标准(如 3 个重复中 ≥2 个扩增)
  • 空白样检出情况及扣除策略
  • 原始数据与代码的公开位置(如 SRA / GitHub)

可参考的规范

  • MIQE 指南:qPCR / dPCR 实验的最低报告信息
  • 欧洲 CEN 关于水体脊椎动物 eDNA 采样与检测的技术规范
  • 各国/地区渔业与环境部门发布的 eDNA 监测技术导则
  • 期刊层面的 eDNA 数据与元数据报告清单

标准仍在快速演进,立项前请核对最新版本。

08 / 脉络

四十年,从微生物到全群落

  1. 1987

    沉积物中的微生物 DNA

    Ogram 等提出直接从沉积物提取胞外 DNA 的方法,"环境DNA"概念雏形出现于微生物生态学。

  2. 2003

    古环境DNA

    Willerslev 等从西伯利亚冻土沉积中恢复更新世植物与动物 DNA,证明沉积物可长期保存遗传信息。

  3. 2008

    水体中的大型动物 eDNA

    Ficetola 等从池塘水中检出入侵美国牛蛙的 DNA —— 标志着 eDNA 进入宏观生物监测领域。

  4. 2012

    宏条形码方法学成型

    Taberlet 等系统阐述 eDNA metabarcoding 框架,二代测序成本下降推动方法迅速扩散。

  5. 2015

    MiFish 引物发布

    Miya 等针对 12S 设计的短片段鱼类通用引物,成为全球鱼类 eDNA 调查的事实标准之一。

  6. 2018–

    走向业务化监测

    ddPCR 普及、自动采样浮标、纳米孔现场测序、国家级参考数据库与技术标准陆续落地。

  7. 现在

    规模化与规范化

    重点从"能不能测"转向"测得准不准、可不可比" —— 定量模型、参考库补全与跨机构标准化成为核心议题。

09 / 常见问题

FAQ

检出了 eDNA,就能说这个物种在这里生活吗?

不一定。信号可能来自上游漂移、捕食者粪便、渔船清洗水、水产市场排水,甚至污水处理厂出水。稳妥的表述是"在该采样点检出了该物种的 DNA",并给出可能的来源假设与水文距离估计。多点位、多时间的重复采样能显著缩小不确定性。

eDNA 浓度能换算成生物量或个体数吗?

存在正相关,但不是可靠的线性换算。释放率随体型、代谢、繁殖期变化,降解率随温度与微生物活性变化。可行做法是在同一水系、同一季节内做相对比较,并用围隔实验或同步传统调查建立本地校准关系。

一次采多少水合适?

没有普适答案。清洁水体常用 1–2 L;高浊度河流可能 250 mL 就堵膜;目标物种极稀有时需要 5 L 以上或多张滤膜。建议先做小规模预试验,以"每站点检出概率 ≥0.95 所需的采样量与重复数"为目标反推。

样品必须现场过滤吗?

强烈推荐。运回实验室再过滤会经历数小时的降解与容器壁吸附。若条件不允许,应立即避光冷藏(≤4 ℃)并在 24 小时内处理,或使用含保存液的采样瓶。滤膜过滤后立刻放入无水乙醇、裂解缓冲液或硅胶干燥,冻存于 −20 ℃/−80 ℃。

宏条形码结果里出现了不可能存在的物种,怎么办?

先排查三类来源:① 参考库错误注释或近缘种误配;② index-hopping 与实验室交叉污染(查空白样);③ 食品/污水等外源输入。处理上应设定最小 reads 与最小样本出现次数阈值,并对关键物种用特异性 qPCR 或 Sanger 测序独立验证。

做一次 eDNA 调查大概需要什么条件?

最低配置:一套现场过滤装置(注射器/蠕动泵 + 滤器)、冷链、常规分子实验室(离心机、PCR 仪、可选 qPCR)、以及测序服务外包。真正的门槛不在仪器,而在污染控制的流程纪律与数据分析能力。

eDNA 和 eRNA 有什么区别?

RNA 在环境中降解更快(通常数小时),因此 eRNA 阳性更能指示"近期有活体"。但采样与保存要求苛刻、成本更高,目前多用于研究场景而非常规监测。

10 / 资源

延伸阅读与工具

参考数据库

  • NCBI GenBank / RefSeq
  • BOLD Systems(COI 为主)
  • MIDORI2(线粒体基因)
  • SILVA / PR²(rRNA)
  • UNITE(真菌 ITS)
  • 各地区自建本土鱼类/植物条形码库

分析工具

  • QIIME 2 · 一体化微生物组与扩增子平台
  • DADA2 · ASV 降噪
  • OBITools3 · eDNA 专用工具集
  • cutadapt · 引物与接头处理
  • VSEARCH · 聚类与嵌合体
  • nf-core/ampliseq · 可复现工作流

入门文献方向

  • Taberlet 等《Environmental DNA: For Biodiversity Research and Monitoring》
  • eDNA 采样与保存方法学综述
  • 占据模型在 eDNA 检出概率中的应用
  • 引物偏好性与定量偏差的评估研究
  • 期刊 Environmental DNA、Molecular Ecology Resources